Cartographie conformationnelle et discontinue CLIPSᵀᴹ

Figure 1 : épitope linéaire et discontinu, comme souligné en rouge dans les diagrammes en ruban de l’ubiquitine. Pour indiquer cette partie de la séquence, l’épitope linéaire est également mis en évidence sur la barre horizontale ; elle indique également la position des séquences de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale.

Élucidation précise et rentable des épitopes conformationnels et discontinus

Étant donné que la grande majorité des anticorps thérapeutiques ont un épitope conformationnel ou discontinu (Figure 1), Pepscan a développé une plateforme unique capable de caractériser ces épitopes avec une grande précision. Chez Pepscan, nous appréhendons la conformation spatiale des épitopes en 3D grâce à la technologie unique CLIPSTM (Chemical Linkage of Peptides onto Scaffolds) que nous avons développée en interne afin de pouvoir cartographier les épitopes situés dans des structures en boucle, en feuille bêta ou hélicoïdales avec des peptides contraints (Figure 2).

 

Figure 2. Les peptides générés de façon linéaire sont cyclisés par l’insertion de cystéines à des endroits spécifiques de la chaîne peptidique. Un agent de liaison chimique est ajouté, qui est ensuite « CLIPSé » sur la séquence pour donner un peptide rigidifié. La formation d’un peptide en boucle est illustrée ici, et il est montré également un exemple montrant qu’un anticorps reconnaissant une boucle de la structure de l’hormone folliculo-stimulante (FSH)qui ne peut être reconnu que si la réaction CLIPS est appliquée.

Trouver des épitopes complets à l’aide de la plateforme de cartographie des épitopes discontinus CLIPSTM

Un épitope discontinu est constitué de parties non adjacentes de la séquence protéique primaire qui forment une conformation en 3D spécifique dans la structure tertiaire de la protéine. La cartographie des épitopes discontinus CLIPSTM applique un modèle de matrice combinatoire (Figure 3) dans lequel les séquences de la protéine cible sont criblées les unes contre les autres via une construction en boucle bi-cyclique. La protéine cible est convertie en une vaste banque de peptides imitant sa structure grâce à des contraintes conformationnelles, et dont les séquences en acides aminées combinent des portions de séquences qui ne sont pas adjacentes dans la séquence primaire, mais sont alors rapprochées via la charpente chimique CLIPSTM. Cette banque mimétique de structure tertiaire basée sur la méthode CLIPS est ensuite synthétisée sur un support solide grâce à la technologie de synthèse de biopuces à haut débit. Si un anticorps se lie à un épitope discontinu, les constructions peptidiques bi-cycliques contenant ces portions de séquences doivent se lier avec une affinité beaucoup plus élevée que leurs homologues à un seul cycle.

Une analyse statistique bioinformatique des données de liaison combinées est utilisée pour définir en détail la séquence et la conformation des épitopes. La cartographie des épitopes discontinus CLIPSTM permet également de détecter les épitopes discontinus impliquant des complexes protéiques dimériques ou multimériques, en introduisant simplement le criblage d’une séquence d’une première protéine dans une boucle par rapport à la séquence d’une seconde protéine dans la seconde boucle.

Figure 3. La protéine cible contenant un épitope conformationnel discontinu (à gauche) est convertie en une banque de peptides linéaires ainsi qu’en constructions CLIPSTM via une conception matricielle combinatoire. Les peptides sont synthétisés sur une puce exclusive et sont convertis chimiquement en constructions CLIPS adoptant une conformation spatiale particulière (à droite). La liaison des anticorps est quantifiée à l’aide d’une lecture automatisée de type ELISA. Les constructions représentant les deux parties de l’épitope discontinu dans la bonne orientation sont optimales aux fins de liaison à l’anticorps.

Étude de cas 1 : la cartographie discontinue de précision CLIPSTM identifie d’autres détails de l’épitope

La majorité des anticorps ont un épitope discontinu, sauf s’ils ont été générés à partir peptides uniques. La cartographie d’un anticorps anti-anthrax à l’aide de la cartographie linéaire et de la cartographie conformationnelle CLIPSTM n’a montré qu’une seule partie de l’épitope. Une cartographie supplémentaire utilisant un balayage de type matriciel de la séquence d’antigènes à travers une boucle bi-cyclique a révélé des sites de liaison supplémentaires directement adjacents à la partie dominante de l’épitope. Bien que la partie dominante ait été trouvée dans le crible linéaire et conformationnel, ce sont souvent ces détails qui déterminent si un anticorps est protégé par un brevet ou s’il y a possibilité d’obtenir une liberté d’exploitation.

Figure 4. La cartographie des épitopes discontinus a fait apparaître d’autres parties de l’épitope pour un anticorps anti-anthrax. Alors que la cartographie linéaire (vert) et conformationnelle (bleu) n’a révélé qu’une seule partie de l’épitope (à gauche), notre analyse matricielle discontinue a dévoilé d’autres parties de l’épitope qui contribuent également à la liaison (à droite). Les peptides de plus forte intensité sont mis en évidence en rouge.

Étude de cas 2 : la cartographie précise des épitopes CLIPSTM permet de distinguer les anticorps monoclonaux anti-CD20

La cartographie précise des épitopes CLIPSTM a mis en exergue des sites de liaison sur le CD20 nettement différents pour deux anticorps médicamenteux et a démontré que l’un des des deux utilisait un site de liaison discontinu unique. Ces informations ont été cruciales pour confirmer la liberté d’exploitation et pour les dépôts de brevets sur ces anticorps. Elles ont également contribué à la compréhension du mécanisme d’action et ont offert une réelle opportunité de différenciation sur le marché.

 

Ofatumumab

Figure 5. La cartographie des épitopes discontinus a fait ressortir des sites de liaison sur le CD20 qui étaient nettement différents pour deux anticorps médicamenteux et a mis en évidence un site de liaison discontinu clair et unique pour l’un des anticorps médicamenteux, confirmant ainsi la liberté d’action.